بایگانی ها

بمباران ژني

 انتقال ژن با وساطت اگروباكتروم
   باكتري هاي جنس اگروباكتريوم زندگي آزادي دارند ولي باكتريهاي خاكي فرصت طلبي وجود دارند كه ظرفيت زيادي براي بر همكنش ژنتيكي با گياهان حساس پيدا كرده اند اين بر همكنش به قرار گرفتن پايدار بخشي باكتري درون ژنوم گياه منتج مي شود.اين توانايي طبيعي باكتري براي تغييرهاي ژنتيكي بافت گياه است كه اساس كلي تكنولوژي انتقال ژن را تشكيل مي دهد. تمام گونه هاي جداسازي شده اگروباكتريوم ، بر اساس علايمي كه روي گياهان ايجاد مي كنند شناخته مي شوند . بنابراين اگروباكتريوم تومه فاسينس ، غده واگروباكتريوم ريزوژنز در محل آلودگي روي گياهان حساس ، ريشه به وجود مي آورد . اين علايم بازگو كننده ،اختلافات اساسي د رفرايند انتقال ژن نيست ولي د ربردارنده قطعه DNA حاوي اطلاعات ژنتيكي است اين قطعه T-DNA,DNA يا DNA انتقال دهنده ناميده مي شود.     اگروباكتريوم حاوي يك پلاسميد است كه T.DNA قسمتي از آن مي باشد به پلاسميد اگروباكتريوم Ti پلاسميد مي گويند كه القاء كننده غده مي باشد بنابراين تبديل دروني يك گونه اگروباكتريوم به گونه ديگر به سادگي با جايگزيني Ti پلاسميد امكانپذير است. آلودگي گياه به اگروباكتريوم با جراحت اتفاقي بافت گياهي آغاز مي شود .محل زخم مخلوطي از چندين تركيب را آزاد مي كند كه ماهيت آن در بين گياهان متفاوت است و اغلب ماهيتي فنلي دارند اين تركيبات از زخم انتشار مي يابند و در غلظتهاي كمتر ، برخي از آن ها شيميو تاكسي مثبتي روي باكتري اعمال مي كنند شيميوتاكسي احتمالاً يكي از عوامل سهيم در كلون سازي محل زخم است چندين عامل ديگر نيز وجود دارند كه ممكن است در اين كلون سازي سهيم باشند .اين عوامل 1ـ تشكيل برون سلولي ميكروفيبريلهاي سلولزي توسط باكتريها روي سطح تماسي يا مجاورتي سلول هاي گياهي 2ـ سنتز و آزاد سازي دسته اي از متابوليت هاي مشتق شده از اسيدهاي آمينه توسط بافت گياهي تغيير شكل يافته كه اوپين ها (opines) خوانده مي شوند، را در بر مي گيرند. يك نقش تركيبات مترشحه از زخم ، القاي برخي ژنهاي باكتريايي است كه بروز آن ها براي انتقال T.DNA الزامي است.
 تنها دو منطقه روي Ti پلاسميد وجود دارند كه براي اين انتقال ضروري هستند . منطقه T.DNA و ديگري منطقه اي كه Vir ( شدت بيماري زايي ) خوانده مي شود .اگر چه اين دو منطقه به تمام پلاسميدهاي رسمي اتصال دارند ليكن آنها نيز موقعي انجام وظيفه خواهند كرد كه جدا شده باشند . اكثر منطقه T.DNA مي تواند حذف يا غير فعال شود بدون آنكه در انتقالش تاثير گذارد ؛ تنها بخشهاي T.DNA كه براي انجام اين عمل ضروري هستند ، 25 جفت بازي هستند كه مستقيماً مجاور منطقه T.DNA زنجيرهاي تكرار شده قرار دارند. منطقه Vir در سلولهاي گياهي تغيير شكل يافته (transformed) يافت نشده است. در باكتري اين منطقه موقعي مي تواند عمل كند كه در مناطق حواشي ‍T.DNA قرار گيرد. اين امر بيان كننده آن است كه ژنهاي Vir ، محصولات آنها ابتدائاً يا منحصراً در باكتري عمل مي كنند.ژنهاي منطقه Vir بايستي نقش عمده اي در انتقال T.DNA بازي كنند. تجزيه و تحليل هاي اخير از ساختار و تنظيم آنها ديدگاههاي ارزشمندي را فراهم نموده است .  رونويسي از بخش اعظم جايگاههاي ژني شناخته شده منطقه Vir به طور همتراز و مثبتي توسط محصولات خود تنظيم شده ژنهاي VirA ، VirG  و تركيبات فنلي موجود در ترشحات جراحتي گياه تنظيم مي شود . احتمال دارد VirA ، VirG با هم يك واحد تنظيمي را تشكيل مي دهد كه Vir A به تركيبات مترشحه زخم در غلظتهاي بيشتر از آنچه كه مورد نياز شيميوتاكسي است ، حساس مي شوند و به نوبه خود با محصول VirG براي فعال كردن رونويسي جايگاههاي ژني VirD,Vir بر همكنش مي دهند.
    چنانكه عنوان شد، T-DNA  منطقه اي از Ti پلاسميد است كه به صورت داخل شده در ژنوم هسته اي سلولهاي گياهي حساس ديده مي شود .در تمام Ti پلاسميدها كه به طور طبيعي يافت مي شوند، ژنهاي موجود در DNA – T شان براي عمل در گياهان تكامل يافته نه در باكتري . بارزترين اين اعمال ، آنهايي هستند كه به توليد اكسين ها سيتوكينين ها يا هر دو منتج مي شود. اين به ظهور علايم بيماري غده زايي واستقلال فيتوهورموني رشد سلول تغيير شكل يافته در محيط كشت منتهي مي گردد . اين تغيير فنوتيپ به از دست دادن توانايي باززايي در بافت تغيير شكل يافته مي انجامد . Ti پلاسميد ناقلي طبيعي براي انجام عمل مهندسي ژنتيك گياهان دولپه است، ليكن دو مشكل بسيار مشهود براي استفاده از آن وجود دارد. اولين مشكل اين است كه اندازه پلاسميد (200 كيلو جفت باز) دستكاري آن را مشكل مي سازد و عمده ترين دليل آن تعداد زياد جايگاههاي آنزيمي محدود الاثر (enzmerestriction)موجود در يك چنين پلاسميد بزرگي است .دوم اينكه فنو تيپ تغيير يافته غده اي مهاجم است و لذا تحت نفوذ در آوردن شرايط رشد جهت باززايي گياهان كامل از سلولهاي تغيير ژنوم يافته بسيار دشوار است. در همين راستا و براي غلبه بر اين مشكلات چندين استراتژي شكل گرفته است. اولين و عمومي ترين استراتژي ، برداشتن منطقه T-DNA  و وارد كردن آن درون يك پلاسميد آزمايشگاهي معمولي همچون PBR322  است. به اين صورت T-DNA        مي تواند در اشريشياكلي كلون شود . اين امر T-DNA كافي براي تحقيق فراهم خواهد كرد. بعد از آن معمولاً قطع ژنهاي Onc صورت مي پذيرد . انجام اين عمل ، اين اطمينان را مي دهد كه اگر سلولهاي گياه ميزبان با T-DNA نو تركيب تغيير شكل يابند، توليد گياه كامل از سلولهاي تغيير شكل يافته ساده تر خواهد بود. سوم اين كه T-DNA باقي مانده مستلزم آن است كه براي دريافت ژنهاي خارجي متناسب شود . در اينجا بايد متذكر شد كه اگر چه ژن نوپالين سنتاز (nos) يك پلاسميد باكتريايي است ، ليكن داراي علايم پروموتور و پاياني است كه به وسيله گياه ميزبان تشخيص داده مي شود. بنابراين ژن نوپالين سنتاز مي تواند به عنوان يك ژن علامت گذار (marker) يا گزارشگر (reporter) براي تغيير شكل مورد استفاده قرار گيرد. در صورتي كه يك علامت گذار انتخابي مورد نياز باشد، ژن باكتريايي به رمز درآورنده نئومايسين فسفوترانسفراز از(NTP ، كه مقاومت به كانامايسين را ايجاد مي كند) اغلب بين علايم پروموتور و پاياني و پس از قطع منطقه به رمز در آورنده نوپالين سنتاز قرار داده مي شود. بنابراين ژن باكتريايي را تحت كنترل توالي هاي تنظيمي نوع شاخصي از گياه در مي آورد. در واقع هر ژني در اين مكان وصل شود ولي براي بسياري از مقاصد ، تحت كنترل درآوردن توالي هاي تنظيمي خود آن ژن جايگزين شده ضروري است.
   بايستي تاكيد كرد كه پلاسميدي چون PBR322 كه حامل يك منطقه T-DNA  دوخته شده (tailored) است، ژنهاي Vir را كه براي انتقال موفق T-DAN به درون ژنوم ميزبان ضروري مي باشند ، شامل نمي شود . اين مشكل با تجهيز كردن ناقل مناسب شده درون اگروباكتريوم كه Ti پلاسميد را حمل مي كند ، حل مي شود. در صورتي كه Ti پلاسميد كامل باشد ، توالي مشتق شده از T-DAN در PBR322 شانس زيادي براي وارد شدن مجدد به درون Ti پلاسميد از طريق نو تركيبي مشابه در توالي هاي كناري تكرار شده ، دارد . اين سيستم به سيستم ادغام مشترك (Co-integrative system) معروف است. راه ديگر اينكه پلاسميد PBR322-T-DNA دوخته شده ممكن است درون سلول اگروباكترويومي كه حامل Ti پلاسميد است و T-DNA از آن حذف گرديده ، وارد شده است. منطقه Vir روي اين پلاسميد نيز در ارتقاء انتقال T-DNA به ژنوم ميزبان موثر است حتي اگر چه DNA-T اكنون در مولكول ديگري قرار گرفته باشد . سيستمهايي از اين قبيل به سيستمهاي ناقل دوگانه (binary Vector sys) معروفند . اين دو سيستم با موفقيت براي انتقال ژنهاي خارجي به سلولهاي گياهي مورد استفاده قرار گرفته اند .
  مهندسي ژنتيك گياهان با T-DNA نو تركيب معمولاً از طريق شناورسازي قطعات برگي روي سوسپانسيوني از اگروباكتريوم واجد پلاسميد مناسب حاصل مي شود. اگروباكتريوم به لبه هاي مجروح قطعات برگي هجوم مي برد و پس از ميزان محدودي تقسيم سلولي ، در حاشيه قطعات برگي ، تشكيل نوساقه از سلولهاي تغيير شكل يافته القا مي شود. سپس نوساقه ها با قرار گرفتن در يك محيط كشت مناسب ، ريشه مي دهند . گياهاني كه بدين طريق مهندسي شده اند، با ژنهاي قرار گرفته تحت كنترل پروموتور nos ، يا از ساير پروموتورهاي طبيعي گياه، حالت كلي تري از بروز ژنها را در سراسر گياه نشان مي دهند . ژنهاي انتقال يافته با DNA هسته اي ميزبان ادغام مي شود و مطابق ژنتيك عادي مندلي توارثي مي شوند. سيستم تجربي مفيد ديگر ، از يك سري آزمايشات بسيار جديدي كه توسط گروه روبرتا اسميت (Roberta smith,s group) در دانشگاه A&M تكزاس انجام شده ، شكل گرفته است . در اين آزمايشات رئوس ساقه اي جدا شده از دانه رستهاي اطلسي به وسيله آلودگي با اگروباكتريوم كه پرونده يك Ti پلاسميد حامل ژنهايي براي مقاومت كانامايسين و بتاگالاكتورونيداز بودند، تغيير شكل يافتند.
       استفاده از اگروباكتريوم حامل پلاسميدهاي نو تركيب با T-DNA مهندسي شده هم اكنون يكي از نويد بخش ترين روشهاي كاربردي تجاري مهندسي ژنتيك گياه است. طيف وسيع ميزبانهاي اگروباكتريوم ، آن را سيستم مناسبي براي به كارگيري در بسياري از گياهان دولپه اي مناسب مي سازد. تا اين تاريخ اكثر آزمايشات روي گياهاني صورت گرفته است كه باززايي آنها بسيار ساده بوده ، بويژه اعضاي خانواده هاي سيب زميني همچون سيب زميني ، گوجه فرنگي ، توتون و اطلسي ، باضافه چندين گونه ديگر از جمله آفتابگردان ، ولي به روشني نيروي بالقوه اي براي كاربرد اين تكنيك ها براي شمار زيادي از محصولات زراعي پهن برگ همچون لوبياي روغني ، شلغم روغني و حتي گونه هاي درختي وجود دارد. به نظر مي رسد در شرايط طبيعي ، اگروباكتريوم گياهان تك لپه اي را آلوده نمي كند. بنابراين دستكاري ژنتيكي غلات با استفاده از يك Ti پلاسميد انتقال يافته به وسيله اگروباكتريوم ، غير عملي به نظر مي رسد . هر چند داده هايي وجود دارند كه بيان مي كنند اگروباكتريوم مي تواند در برخي شرايط ، تك لپه ايها را آلوده كند، ليكن تشكيل Crown-gll را باعث نمي شود.


۴ نظر
  • Jamshid Amini
    Jamshid Amini .ممنون جناب مهندس عالی بود
    اما لطفا یه کم فونتت رو درشت تر انتخاب کن کور شدیم :)
  • Jamshid Amini
    Jamshid Amini .
    . طيف وسيع ميزبانهاي اگروباكتريوم ، آن را سيستم مناسبي براي به كارگيري در بسياري از گياهان دولپه اي مناسب مي سازد. تا اين تاريخ اكثر آزمايشات روي گياهاني صورت گرفته است كه باززايي آنها بسيار ساده بوده ، بويژه اعضاي خانواده هاي سيب زميني همچون سيب زميني ...  بیشتر
  • Jamshid Amini
    Jamshid Amini .توضیحات تکمیلی :
    این روشی که جناب مهندس در اینجا درج فرمودند یکی از روشهای اصلاح نباتات بود.
    در کل تکنیک های جدید انتقال ژن به دو گروه تقسیم میشوند :
    1.انتقال توسط ناقل ( که این روشی که جناب مهندس اشاره فرمودند یکی از این روشها بود.)
    2.انتقال مستقیم (بد...  بیشتر
  • اسماعیل محمدزاده
    اسماعیل محمدزاده چشم جناب مهندس...
    بسیار ممنونم از دقت و توجهتون و نیز توضیحات تکمیلی...
    یاشاسین...
    ۱۳۹۲/۱۲/۱۸