بایگانی ها

امتزاج پروتوپلاست و کاربرد آن در اصلاح نباتات

پروتوپلاست سلولی است که دیواره آن به طور کامل حذف شده است . امتزاج پروتوپلاست عبارت است از ‏اخطلاط پروتوپلاست های گیاهی ( سلول های عاری از دیواره سلولی ) از سلول های سوماتیکی گونه های ‏متفاوت و تجدید نسل گیاهان هیبرید حاصل از پروتوپلاست های مخلوط شده می باشد‏‎ .‎
‎ ‎اولین تلاش موفقیت آمیز در امتزاج پروتوپلاست گل اطلسی توسط پاور و همکارانش‏‎ ( Power . ‎‏۱۹۷۶‏‎ ) ‎در ‏انگلیس و نیز کارلسون و همکارانش‏‎ ( Carlson . ‎‏۱۹۷۵‏‎ ) ‎در آمریکا در تنباکو بود . بعد از جداسازی ‏پروتوپلاست تنها مانع بین سیتوپلاسم و محیط خارجی غشاء پلاسما می باشد . فقدان دیواره سلولی باعث برقرار ‏شدن تماس نزدیک غشاء پلاسمایی دو یا چند پروتوپلاست می شود که این امکان تحت شرایط طبیعی وجود ندارد ‏وقتی غشاء پلاسمایی دو پروتوپلاست با هم تماس می یابند ، تحت بعضی شرایط آنها همانند دو حباب صابون به ‏همدیگر خواهند چسبید . بعدا ً اگر محرک مناسبی بر روی آنها اعمال شود بار دیگر مثل دو حباب صابون با ‏یکدیگر امتزاج یافته و به صورت یک گوی احاطه شده با یک غشاء درمی آیند . امروزه توجه زیادی برای امتزاج ‏پروتوپلاست به عنوان یک وسیله بهنژادی گیاهان صورت می گیرد . اگرچه نتایج مثبت در این زمینه جهت تولید ‏گیاهان زراعی اصلاح شده خیلی نادراست ولی اشخاص زیادی امتزاج پروتوپلاست را یک وسیله مفید برای ‏اصلاح گران می دانند که آنها می توانند با استفاده ازاین روش گونه های ناسازگار جنسی را باهم تلاقی داده و ‏صفات هسته ای و سیتوپلاسمی را منتقل نمایند . امتزاج پروتوپلاست را می توان برای تلاقی درون گونه ای ، ‏درون جنسی و بین جنسی به کار برد . امتزاج پروتوپلاست ابزاری در جهت نیل به توارث فراجنسی ژنوم های ‏اندامکی هر دو والد به شمار می رود . در فراورده های الحاقی که هسته ها ، پلاست ها و میتوکندری های هر دو ‏والد در یک سلول حضور دارند ، اجتماع تازه ای از هسته یک گونه و اندامک های یک گونه دور پدید می آید . ‏از طرفی نیز اثرات متقابل در سطح‏‎ DNA ‎بین ژنوم های اندامکی موجبات خلق ژنوم های مورد علاقه در ‏اصلاح نباتات می شود . امتزاج پروتوپلاست و دوروگ گیری سوماتیکی در جنس ها و گونه هایی انجام می شود ‏که تلاقی پذیری ندارد . این کار به منظور دست کاری گونه های گیاهی و در جهت افزایش تنوع ژنتیکی و ایجاد ‏صفات و یا گیاهان جدید و تولید سیبریدها ( دورگ های سیتوپلاسمی ) استفاده می شود . با توجه به اینکه امتزاج ‏پروتوپلاست برای آمیزش گونه هایی که نمی توان به صورت جنسی تلاقی یابند استفاده می شود ، لذا امتزاج ‏پروتوپلاست را دورگ گیری شبه جنسی‎ ( parasexual hybridization ) ‎نیز نام گذاری کرده اند ، این فنون با ‏رفع محدودیت تلاقی های بین گونه ای و بین جنسی از طریق کشت تخمک نارس یا بالغ‏‎ ( Invitrro ‎pollination ) ‎و با بکارگیری فنون نجات ( یا کشت ) جنین‎ ( embrio rescue ) ‎به عنوان مکمل روش های ‏اصلاح سنتی عمل نمایند . پومیتو‎ ( Pomato ) ‎تنها گیاه جدیدی است که از طریق امتزاج پروتوپلاست گوجه ‏فرنگی و سیب زمینی تولید شده است ولی هنوز بهره برداری کشاورزی ندارد‏‎ . ‎امتزاج پروتوپلاست و تبادل سیتوپلاسم ها‏
در صورتیکه هدف ادغام هسته یک والد با سیتوپلاسم کامل والد دیگر است و درصورتیکه فراوانی دورگ های ‏هسته ای بالا باشد می توان سیتوپلاسم بخشنده را به وسیله اشعه ایکس یا گاما در زمان قبل از امتزاج پرتو تابی ‏کرد . این تیمارهیچ گونه اثر زیان آور بر روی ژنوم اندامک های نتایجی که پروتوپلاست آنها تابش دیده ندارد ، ‏زیرا ژنوم ها تکرار زیادی دارند . برای اینکه صرفا ً اندامک های سیتوپلاسمی والدپرتو دیده نگهداری شود . ‏مجیسی و همکاران ( ۱۹۸۰ ) برای حذف اندامک های والد دیگر ، استفاده از روش بازدارندگی متابولیکی که ‏برای اولین بار در ژنتیک سلولی پستانداران مطرح شد پیشنهاد کردند‏‎ ( Medgyesy ‎، ۱۹۸۰‏‎ ) . ‎موادی مانند ‏استات ید و استامیدید که بدین منظور و در این روش استفاده می شود ، پرتوتابی سیتوپلاسم والد بخشنده و عدم ‏فعالیت متابولیکی هسته ای والد گیرنده را در هم ادغام می کند ( روش بخشنده - گیرنده ) و در حال حاضر به ‏طور معمول استفاده می شود‏‎ .‎
امتزاج پروتوپلاست و نوترکیبی ژنوم های پلاست‏
تفرق تصادفی تیپ های والدی در نسل های متوالی سلولی ، فراوانترین الگوی رفتاری توده مخلوط پلاست ها در ‏یک فرآورده امتزاج به شمار می رود . اینگونه موارد در گزارش های متعدد هیبریدهای رویشی ( با هسته های ‏هیبرید ) و هیبریدهای سیتوپلاسمی ( سایبریدها ) به تایید رسیده است . تحقیقات انجام شده حاکی از وقوع نوترکیب ‏ژنوم پلاست در گیاهان عالی پس از دورگ گیری رویشی است ( بین‎ N.plumbaginifolia ‎و‎ N.tabacum ) . ‎در هر دو مورد ، از جهش یافته های پلاست که مشخصه آنها مقاومت به آنتی بیوتیک یا توکسین و آلبینیسم می ‏باشد استفاده شده است . کمبود نوترکیبی پلاستی مانع انجام هرگونه تخمین دقیق از فراوانی این نوترکیبی ها در ‏سلول های هتروپلاست حاصل از الحاق می شود . معلوم شده است کلید این موفقیت ها که استفاده از فشار گزینشی ‏شدید بوده فقط زمانی امکان دارد که پلاست های جهش یافته به کار گرفته شوند . تجزیه و تحلیل مولکولی ژنوم ‏های پلاست به دست آمده در نوترکیب های نیکوتیانا نشان داده است که از تعداد زیادی کراسینگ اور ناشی شده ‏اند‎ .‎
امتزاج پروتوپلاست و نو ترکیبی ژنوم های میتوکندریابی
نر عقیمی سیتوپلاسمی که در طیف وسیعی از گونه ها پیدا می شود تنها نشانگر ژنتیکی است که توسط ژنوم ‏میتوکندری هدایت می شود . از این پدیده برای پیگیری سرنوشت ژنوم های میتوکندری در امتزاج پروتوپلاست ‏استفاده می کنند . فقدان فشار گزینشی در سطح سلولی مانعی در سر راه بدست آوردن نوترکیبهای میتوکندریابی ‏محسوب نمی شود . وقوع نوترکیبی معمولاً با یک فراوانی بالا رخ می دهد . مطالعات مولکولی قطعات محدود ‏شده جدید میتوکندریابی در هیبریدهای رویشی یا سایبریدهای اطلسی و براسیکا تبادل‏‎ DNA ‎والدین را به خوبی به ‏اثبات رسانده است . در نتیجه ژنوم میتوکندریابی با ترکیبی جدید نوترکیبی جدید و ترکیبی منحصر به فرد از توالی ‏های والدی درهر سایبرید باززایی شده است . مطالعات امتزاج ، گیاهان نر عقیم سیتوپلاسمی را نیز شامل می ‏شود . فنوتیپ سیتوپلاسمی در طول در طول مرحله گلدهی مشخص می گردد . در نیکوتیانا ، نرعقیمی ها بوسیله ‏سیتوپلاسم گونه های مختلف القاء می شود . در این ترکیبات آلوپلاسمی ، پرچم ها به طور کلی حذف و یا اینکه به ‏ساختارهای شبه ماده و یا گلبرگ مانند تغییر می یابند . هر سیتوپلاسمی را می توان از طریق ظاهر خاص گل ‏شناسایی کرد . جنبه جالب توجه نوترکیبی میتوکندریابی حاصل از نیکوتیانای طبیعی و عقیم ، پیدایش ظواهری ‏جدید در گلی است که با هر دو والد متفاوت است . این گونه نوترکیبات که در بین ژنوم های میتوکندریابی را در ‏بین گونه ها نوید می دهد‏‎ .‎
کاربرد امتزاج رویشی در دست ورزی گونه های زراعی
ژنوم های پلاستی که با یکدیگر در یک سلول منفرد ادغام می شوند . در مواقعی که یکی از والدین فاقد رقابت و ‏یا از رقابت کمتری در مقایسه با دیگری برخوردار است این امر خیلی سریعتر به وقوع می پیوندد . بالعکس ، ‏ژنوم های میتوکندریابی نوترکیب همراه با ژنوم پلاست یکی از والدین را دارا هستند‏‎ .‎
انتقال سیتوپلاسم های نر عقیم به ارقام مختلف‏
امتزاج پروتوپلاست ابزاری برای انتقال تک مرحله ای یک سیتوپلاسم نر عقیم به واریته های مختلف بارور است ‏‏. بدین ترتیب چرخه های متعدد تلاقی برگشتی مورد نیاز در روش های معمول تلاقی جنسی منتفی می گردد . در ‏برنج گیاهان سایبرید حاوی هسته واریته بارور و میتوکندری های نوترکیب هر دو والد ، نر عقیمی والد نر عقیم ‏را با خود حفظ کرده است‎ .‎
‎ ‎این موفقیت بر اساس روش بخشنده - گیرنده صورت گرفته است‏‎ ( Sidorov ‎، ۱۹۸۱‏‎ ) ‎در هویج نیز بر مبنای ‏همین روش ، نرعقیمی سیتوپلاسمی ( بساک قهوه ای ) به یک رقم بارور منتقل شده است . در براسیکا ، به ارقام ‏مختلف منداب روغنی ، نر عقیمی سیتوپلاسمی انتقال یافته است . همچنین یک سیتوپلاسم سایبرید نرم عقیم اصلاح ‏شده را که قبلاً از طریق دو رگ گیری رویشی به دست آمده بود به منداب روغنی زمستانه انتقال داده اند . در ‏چغندرقند باززایی گیاه کامل از پروتوپلاست ها ، امکان انتقال سیتوپلاسم از منابع مختلف نر عقیم سیتوپلاسمی را ‏به زمینه های مختلف هسته ای فراهم ساخته است . این روش در گونه مذکور از اهمیت خاصی برخوردار است ‏زیرا چغندرقند دو ساله بوده و تولید هیبرید در جهان صرفاً بر مبنای نر عقیمی اون‏‎ ( Owen CMS source ) ‎‎(‎‏۱۹۴۵‏‎) ‎است به طوری که این محصول به طور بالقوه در برابر نژادهای جدید پاتوژن ها آسیب پذیر می گردد . ‏در توتون بر مبنای ادغام پروتوپلاست‏‎ N.plumbaginifolia ‎با‎ N .tabacum ( ‎حاوی پروتوپلاست پرتو دیده ) ‏تیپ جدیدی از نر عقیمی سیتوپلاسمی خلق شده است . ترکیب مذکور به خصوص در موقعی که گونه دوم به ‏عنوان والد مادری در نظر گرفته می شود به طور جنسی ناسازگار است‏‎ .‎
اصلاح سیستم های نر عقیمی سیتوپلاسمی در چلیپاییان
دارند ، ‏‎( B.napus,... ) ‎و روغن‎ ( B.oleracea ,... ) ‎محصولات کلمیان اهمیت اقتصادی مهمی از نظر سبزی ‏برای مصارف انسانی و صنعتی پس از سویا و نخل سومین منبع مهم روغن به شمار می روند . با اینکه واریته ‏های هیبرید در این گونه ها بر مبنای سیستم های خود ناسازگاری تولید شده اند . نر عقیمی سیتوپلاسمی پیدا شده ‏در تربچه به براسیکا اولراسیا و براسیکا ناپوس از طریق تلاقی بین گونه ای منتقل گردید ولی گیاهان حاصله ‏ضمن اینکه به طور کامل نر عقیم بودند به خاطر نقص کلروفیلی در دماهای پایین و ناهنجاری های گل ( تولید ‏ناقص شهد و کاهش باروری ماده ) عملا ً قابل استفاده نبودند . در بررسی پلتیرو همکاران به منظور تبادل ‏کلروپلاست های تربچه با کلروپلاست های براسیکاونیل به سنتز طبیعی کلروفیل ، امتزاج رویشی بین پروپلاست ‏های براسیکای حاوی اندامک های تربچه و پروتوپلاست های دارای اندامک های براسیکا صورت گرفت و از ‏بین گیاهان باززایی شده گیاهان سبز طبیعی و نر عقیم جدا شدند‏‎ ( Pelletier ‎، ۱۹۸۳‏‎ ) ‎آنها نشان دادند که حاوی ‏ژنوم های نو ترکیب میتوکندریابی هستند . در بین این سایبریدها ، بعضی توسط متخصصین انتخاب شدند ، زیرا ‏در آزمایش های مزرعه با نتاجشان ثابت کردند که سایر نقایص مربوط به مرفولوژی گل در آنها رفع شده است‏‎ .‎
تولید شهد در این گیاه آنقدر کافی بود که همانند گیاه بارور زنبورها را جلب و تشکیل بذر طبیعی گشت . این ‏ویژگی ها با وقایع نوترکیبی بین ژنوم های میتوکندریابی دو والد همبستگی داشت . بر اساس نتایج بدست آمده از ‏سایبرید های براسیکا این نکته به اثبات رسید که از جنبه اصلاحی فقط بایستی بخش کوچکی از ژنوم بیگانه به ‏درون گونه زراعی وارد گردد . زمانی که یک ژنوم صفت مطلوبی مانند نر عقیمی سیتوپلاسمی را با خود دارد و ‏ژنوم کامل اندامک منتقل می گردد . به خاطر اثر متقابل بقیه ژن ها با هسته گونه زراعی ، معایب زراعی احتمال ‏ظهورشان بالاست . این نتایج اهمیت عملی نوترکیبی میتوکندریابی که مجال حذف این صفات نامطلوب را فراهم ‏می کند به اثبات می رساند . از این سیتوپلاسم ها در حال حاضر توسط متخصصین اصلاح نباتات استفاده میشود‎ .‎
هیبریداسیون سلول سوماتیکی
هیبریداسیون سلول سوماتیکی که لقاح سلول سوماتیکی یا لقاح پروتوپلاست نامیده می شود دلالت بر اتحاد ‏پروتوپلاست گیاهی سلول های سوماتیک گونه های مختلف و متعاقباً باززایی گیاهان هیبرید حاصل از ‏پروتوپلاست های لقاح شده دارد . این روش برای استفاده در به نژادی گیاهی برای ایجاد هیبرید با اتحاد سلول ‏های سوماتیک که در آن گیاه به طریقه دو رگ گیری جنسی تلاقی های بین گونه ای تهیه بذر امکان پذیر نباشد ، ‏توصیه شده است . هیبریداسیون سلول سوماتیکی فرآیندی چند مرحله ای شامل ایزوله نمودن پروتوپلاست های ‏گونه های مختلف ، امتزاج پروتوپلاست های دو گونه مختلف ، شناسایی نمودن پروتوپلاست های لقاح یافته هیبرید ‏و باززایی گیاهان هیبرید دور از پروتوپلاست های لقاح شده می شود . قبل از اتحاد سلول های گیاهی ، حذف ‏دیواره سلولی جهت تولید پروتوپلاست های بدون دیواره ضروری است . سلول های مزوفیل برگ یا سایر بافت ‏های گیاهی ، کالوس یا کشت های سوسپانسون سلولی با آنزیم های هضم کننده دیواره سلولی برای بدست آوردن ‏سوسپانسیون پروتوپلاست ها ، تیمار می گردند . برای دو رگ نمودن پروتوپلاست های خالص گونه ها آنها را ‏مخلوط نموده و به همراه یک عامل آمیخته کننده غالباً پلی اتیلن گلایکول سانتریفوژ می نمایند . تا آنجا مخلوطی از ‏پروتوپلاست های والدی ، پروتوپلاست های آمیخته شده هیبرید بوجود می آید . پروتوپلاست های هیبرید به سلول ‏های دارای دیواره و ادامه تقسیم سلولس وادار شده و در نهایت گیاهچه های دارای ریشه و ساقه تولید می گردند . ‏هیبریداسیون سلول سوماتیکی هنگامی به عنوان روشی برای اصلاح کننده نبات مورد استفاده می باشد که تکنیک ‏های متداولی برای کشت پروتوپلاست گونه والدین ایجاد گردد‏‎ .‎
‎ ‎باززایی گیاه از پروتوپلاست های بعضی از گونه ها مثل سیب زمینی ، توتون ، یونجه و تعداد اندکی از گونه ‏های دیگر به راحتی امکان پذیر است در حالی که در غلات و حبوبات به سختی قابل اجرا می باشد . سلول های ‏بین گونه های خویشاوند دور اغلب آنیوپلوئید بوده و به ندرت باززایی شده و در صورت باززایی شدن گیاهانی ‏عقیم بدست می آید‎ .‎
روش های القاء امتزاج‏‎ :‎
امتزاج خود بخودی
همانطور که از اسم این روش مشخص است روشی است که در آن امتزاج پروتوپلاستی بدون دخالت دادن هر نوع ‏ماده امتزاج دهنده یا استفاده از محرک صورت می گیرد . امتزاج خود بخودی برای اولین بارتوسط کاستر در سال ‏‏۱۹۰۲ تشریح شد . عیب عمده این روش این است که امتزاج به ندرت اتفاق می افتد . به کاربردن امتزاج خود ‏بخودی تولید پروتوپلاست های چند هسته ای در سویا را که هسته های آنها به طور همزمان تقسیم می شوند امکان ‏پذیر ساخته است . فراوانی اندک امتزاج با این روش مانع از توسعه آن گردیده و لذا تاکید بیشتر بر روش های ‏آزمایشی امتزاج که ذیلاً تشریح می شود صورت می گیرد‎ .‎
روش القاء امتزاج با پلی اتیلن گلیکول‎ ( PEG )‎
روش استفاده از پلی اتیلن گلیکول به عنوان یک ماده القاء کننده امتزاج ، برای اولین بار توسط کائو در میکالوگ ‏و والین و همکاران (۱۹۷۴) تشریح شده است‏‎ .‎
PEG ‎یک پلیمر آلی است که با وزن های مولکولی متفاوت قابل دسترس می باشد . موثرترین دامنه ۱۵۴۰‏‎ PEG ‎، ۴۰۰۰‏‎ PEG ‎و ۶۰۰۰‏‎ PEG ‎می باشد . برای القاء امتراج با‏‎ PEG ‎آن را به محیط کشت اضافه می نمایند و در ‏این ماده مخلوط پروتوپلاست های قابل امتزاج را به حالت سوسپانسیون در می آورند . معمولا ً از‎ PEG ‎‏۳۳‏‎- ‎‏۲۵‏‎ ‎درصد ( حجمی / وزنی ) استفاده می شود . باید دقت کرد از مقدار درست و اندازه و اندازه مولکولی صحیح‎ ‎PEG ‎استفاده کرد . افزودن مقدار زیادی از این ماده باعث انعقاد توده های پروتوپلاست می گردد و اضافه کردن ‏مقدار خیلی کم آن موجب چسبیدن پروتوپلاست ها به جای امتزاج می شود . کار با‎ PEG ‎بایستی به دقت مورد ‏ارزیابی قرار گیرد ، زیرا این ماده در سلول ها باعث مسمومیت می گردد . به طور معمول ، مخلوط پروتوپلاست ‏را با‎ PEG ‎به مدت ۱۰ تا ۳۰ دقیقه در انکاباتور قرار می دهند . بعد از این مدت‏‎ PEG ‎را می شویند تا از مخلوط ‏حذف گردد . اکثر امتزاج ها در مرحله شستشو قرار می گیرد‎ .‎
بکار بردن‏‎ PEG ‎به عنوان یک ماده القاء کننده امتزاج امروزه بطور وسیع مورد استفاده قرار می گیرد‎ .‎
روش استفاده از کلسیم و‏‎ PH ‎بالا
این روش شامل قرار دادن مخلوط پروتوپلاست در ۵./. مول کلروکلسیم با‏‎ PH ‎برابر ۵/۱۰ در ۴/. مول مانیتول ‏درون انکوباتور می باشد‏‎ ( Keller and Melchers ‎‏۱۹۷۳‏‎ ) ‎پروتوپلاست ها را بعد از آن به مدت ۳ دقیقه در ‏سرعت پایین سانتریفوژ‎ ( g ×‎‏۵۰‏‎ ) ‎در درون مخلوط قرار می دهند . کلروملچر موفقیت درامتزاج ۲۵ درصد ‏پروتوپلاست ها را گزارش کرده اند . این روش برای امتزاج پروتوپلاست های مزوفیل برگ و پروتوپلاست های ‏بدست آمده از سلول های کشت شده مورد استفاده قرار گرفت . پروتوپلاست های امتزاج یافته با مشاهدات چشمی ‏قابل تشخیص هستند‏‎ .‎
استفاده از نیتریت سدیم
اضافه کردن نیتریت سدیم‎ ( No Na‏۵‏‎ ) ‎به مخلوط پروتوپلاست ها به امتزاج آنها کمک می کند . استفاده از این ‏روش توسط پارو و همکاران ( ۱۹۷۰ ) در موقع امتزاج درون گونه ای و بین گونه ای در پروتوپلاستهای یولاف ‏و ذرت توسعه یافت . نیتریت سدیم امتزاج بین پروتوپلاست های با سیتوپلاسم زیاد ، پروتوپلاست های با واکوئل ‏کم و پروتوپلاست های ریشه را القاء می کند . به طوری که هر چه پروتوپلاست ها متمایزتر باشند به همان میزان ‏القاء امتزاج آسان تر خواهد شد‎ .‎
روش های مصون سازی
هارتمن و همکاران ( ۱۹۷۳ ) روش مصون سازی القاء امتزاج پروتوپلاست را تشریح کردند . آنها پادتنی را با ‏تزریق عصاره های گیاهی به بدن خرگوش تولید کردند . خرگوش دامنه وسیعی از آنتی بادی را بر ضد پروتئین ‏های مختلف گیاهی تولید کرد . سپس اثر این پادتن را در امتزاج پروتوپلاست های به دست آمده از‏‎ Bromus ‎، ‏سویا و باقلا مورد مطالعه قرار دادند . این پادتن پس از امتزاج پروتوپلاست ها باعث آخته شدن گردید . ‏پروتوپلاست های امتزاج یافته قوه نامیه خود را حفظ کرده و حتی تقسیمات سلولی هم در آنها مشاهده گردید‎ .‎
امتزاج مکانیکی
میشل و اسچریک ( ۱۹۷۱ ) از روش های فیزیکی نظیر فشارهای مکانیکی القاء امتزاج پروتوپلاست استفاده می ‏کردند . این روش ها به لحاظ راندمان کم آنها در تولید دورگ ها کمتر مورد توجه قرار گرفتند . ولی یکی از ‏محاسن این روش این است که هیچ ماده شیمیایی که ممکن است عوارض جانبی داشته باشد ، مثل ایجاد موتاسیون ‏در سلول های کشت شده ، در اینجا به کار نمی رود‏‎ .‎
امتزاج الکتریکی
اگر پروتوپلاست را در یک محیط کشت سلولی حاوی الکترود قرار دهند و به آنها انرژی های پتانسیل مختلف ‏وارد نمایند پروتوپلاست ها بین دو الکترود در یک خط قرار می گیرند‎ . ( Zimmer , man ‎‏۱۹۸۲‏‎ ) . ‎اگر ‏شخص در این موقع شوک های الکتریکی با موج های مربعی کوتاه وارد نماید می تواند القاء پروتوپلاست را ‏فراهم سازند . این روش به خاطر قابلیت کنترل بالای ذاتی از معروفیت زیادی برخوردار است . در حقیقت امتزاج ‏دو پروتوپلاست با این روش امکان پذیر است‎ .‎
روش های دیگر
کامیا‎ ( Kameya ) ‎استفاده از ژلاتین با غلظت ۲ تا ۵ درصد را به یک ماده امتزاج دهنده گزارش نموده است . ‏او همچنین نشان داده است که‏‎ ( PotassiumDextranSulphate ) ‎ماده امتزاج دهنده خوبی است . از مواد ‏شیمیایی دیگر که به عنوان مواد امتزاج دهنده با درجات مختلف استفاده شده است . کانکانوالین آ‏‎ ( ‎AConcanvalin ) ‎پلی - ال - ارنیتین ، سیتوچلازین بی ، پلی - ال - لایزین ، گلیسرول و دی متیل سولفوکسید را ‏می توان نام برد . ظاهراً روش های مختلف و زیادی برای القاء پروتوپلاست موجود است . در اکثریت این روش ‏ها ، دو نوع پروتوپلاست با منشا مختلف در حضور ماده امتزاج دهنده با هم مخلوط می کنند و اجازه می دهند آنها ‏به طور تصادفی با هم امتزاج یابند . مشکل این روش این است که پروتوپلاست نه تنها با سلول های هم نوع خود ‏امتزاج می یابد بلکه با انواع دیگر هم می تواند ترکیب شود . روش هایی جهت شناسایی امتزاج های مطلوب که ‏بطور طبیعی از امتزاج پروتوپلاست های نوع‏‎ A ‎با پروتوپلاست های نوع‏‎ B ‎حاصل می شود وجود دارد . در ‏زیر به چند روش که برای غربالگری دورگ های سماتیکی استفاده شده است اشاره می کنیم‎ .‎
‎ ‎الف - غربالگری مشاهده ای : از این روش برای غربالکری گیاهان حاصل از پروتوپلاست هایی که دارای ‏صفات فیزیکی مشخصی هستند استفاده می شود . نتیجه این امتزاج تولید دورگی است که دارای واکوئل های ‏حاوی کلروپلاست و آنتوسیانین با دو هسته می باشد . همچنین این روش می تواند برای امتزاج پروتوپلاست های ‏بدست آمده از مزوفیل برگ و پروتوپلاست های سلول های کشت شده فاقد کلروفیل نیز مورد استفاده قرار گیرند . ‏تکنیک ارزیابی مشاهده ای گاهی با روش کشت قطرات ریز‎ ( Microdrop ) ‎با هم به کار برده می شود . این ‏قطرات ریز به طریق میکروسکوپی مورد آزمایش قرار گرفته است ، آن قطراتی که در آنها امتزاج انجام شده ‏است نشان دار می کنند تا نمود بعدی آن را دنبال کنند . عیب عمده این روش آن است که خیلی پر زحمت بوده و ‏تعداد محدودی از محصول امتزاج یافته را می توان غربالگری کرد‏‎ .‎
ب - نشان های فلورسانس : استفاده از روش های رنگی فلورسنت برای اولین بار توسط کلر ( ۱۹۷۷ ) برای ‏مطالعه امتزاج در سلول های گیاهی تشریح گردید . بعد ها از این روش برای امتزاج پروتوپلاست گیاهی جدا شده ‏قابل استفاده شد . این روش بر این پایه برنامه ریزی شده است که اگر از دو پروتوپلاست اصلی کشت شده یکی ‏را در‎ sceininofluorece Octadecony ‎و دیگری را در‏‎ Palamine B Octadecy ‎به مدت ۱۲ تا ۱۵ ساعت ‏درون انکوباتور قرار دهند ، هر گروه از این پروتوپلاست ها توسط یک رنگ ویژه فلورسانس رنگ آمیزی ‏خواهند شد . این مواد رنگی برای پروتوپلاست ها ایجاد مسمومیت نکرده و صدمه ای به قوه نامیه ، بازآفرینی ‏دیواره و رشدشان وارد نمی سازند . پس از ایجاد امتزاج و تولید محصول امتزاج یافته ، شناسایی این دو رگ ها با ‏مشخصات فلورسانس مربوطه زیر میکروسکوپ فلورسانس امکان پذیر خواهد بود و با استفاده از یک ‏میکرومانیپولار هنوز یک روش وقت گیر بوده و نیاز به مهارت دارد‏‎ .‎
ج - استفاده از دستگاه غربالگر سلولی فعال شده با فلورسانس : پروتوپلاست را با فلورسانس نشان دار می کنند که ‏در بخش ( ب ) بیان گردید . پس از امتزاج سه نوع فلورسانس می توان مشاهده کرد : دو نوع از آنها فلورسانس ‏های اصلی از جمعیت والدین می باشند و نوع سوم فلورسانس دورگ های حاصل از امتزاج است . این روش ‏هنوز در مرحله آزمایشی است ولی با این روش می توان هزاران محصول امتزاج را جدا نمود . عیب عمده این ‏تکنیک ظاهر فریبی و هزینه آن می باشد‏‎ .‎
چ - غربالگری با توجه به مواد غذایی : در حالت های ویژه ، کارلسون و همکاران توانستند محصول دو رگ ( ‏امتزاج یافته ) را با امکان کشت آنها در روی ماده غذایی که در آن امکان رشد برای لاین های والدین پروتوپلاست ‏وجود ندارد جدا نمایند . کارلسون توانست پروتوپلاست های والدین و محصول امتزاج یافته را در محیط کشت فاقد ‏اکسین کشت نماید . در این محیط دو لاین سلولی مربوط به والدین به خاطر فقدان اکسین در محیط کشت نتوانستند ‏رشد کنند . ولی سلول های دو رگ تولید کننده اکسین توانستند رشد کرده و به کالوس تبدیل شوند . کارلسون ‏توانست این گیاهان دورگه سوماتیکی را با گیاهان تولید شده با تلاقی جنسی متداول مقایسه نماید‎ .‎
ح - حساسیت به نور : ملچرولبیب ( ۱۹۷۴ ) یک روش برای غربالگری دو رگ ها بر اساس مکمل ژنتیکی ‏تشریح نمودند . آنها دو موتانت توتون را یکی با کلروفیل ناقص و دیگری حساس به نور را از توتون‏‎ ( ‎Tobacum N ) ‎در آزمایش های خود بدست آوردند . وقتی پروتوپلاست های این دو گیاه را با هم امتزاج دادند ، ‏نتیجه دستیابی به یک گیاه سبز نرمال بود . به این جهت در موقع بازآفرینی گیاهچه از مخروط پروتوپلاست دو ‏کلون والدین به نور حساس بودند . ولی گیاهچه دو رگ یک گیاه سبز نرمال بود . این یک روش دقیق برای ‏غربالگری دورگ های سوماتیکی است‏‎ .‎
نیاز برای تولید تعداد بیشماری موتاسیون های قابل غربالگری یعنی گیاهچه حساس به نور و دارای کلروفیل ‏ناقص برای این نوع مطالعات زیاد است‏‎ .‎
د - حساسیت به دارو و مقاومت : پاور و همکاران ( ۱۹۷۶ ) از حساسیت گیاهان بر اکتینومایسین دی برای ‏غربالگری محصولات امتزاج حاصل از اطلسی‎ nia hybrida , P.parodii ‎استفاده کردند . دو گیاه والدینی به ‏اکتینومایسین - دی حساس ولی گیاه دو رگ مقاوم به آن می باشد . پاور توانست دو رگ های سوماتیکی را در ‏حضور اکتینومایسین - دی در ماده غذایی بازآفرینی نماید . بعضی از محققین حالا به دنبال تولید موتانت های ‏بسیار مقاوم هستند تا در مطالعات امتزاج پروتوپلاست از آنها استفاده شود‏‎ .‎
چه گیاهانی را باید دورگ گیری کرد ؟‏
در اوایل سال ۱۹۶۰ بیولوژیست های گیاهی می خواستند بین علم و افسانه علمی تلاقی انجام دهند و امتزاج ‏پروتوپلاست تا حدودی مطرح شد که بیشتر خیالی بود‏‎ .‎
‎ ‎به عنوان مثال می خواستند بین هویج و کلم پیچ دورگ گیری انجام دهند به طوری که در قسمت هوایی تولید کلم ‏و در زیر خاک ریشه هویج بدست آورند . نظیر آرزوی بشر در تولید پومیتو‎ ( Pomato ) ( ‎در قسمت هوایی ‏گوجه فرنگی و در قسمت زیرین سیب زمینی ) دورگ گیری به عنوان یک سیستم مدل برای مطالعه گوجه فرنگی ‏و سیب زمینی موفق بود گرچه این روش دورگ های سوماتیکی را تولید کرده و برای مطالعات پایه مفید است ‏ولی تا بحال گیاه زراعی با ارزش از این روش به دست نیامده است . اخیراً امتزاج پروتوپلاست سیب زمینی های ‏دارای ناسازگار جنسی‎ S.brevidens . S.tuberosum ‎انجام شده است . دورگ های ایجاد شده با روش امتزاج ‏سماتیکی بارور بود و حاوی ژن های مهم مقاومت والد‏‎ S.brevidens ‎مثلاً مقاومت به ویروس پیچیدگی برگ‏‎ ( ‎PLRV ) ‎می باشد . این روش با اینکه قابل استفاده است ولی از آن نمی توان مستقیماً برای تولید گیاهان زراعی ‏مفید بهره برداری کرد اما یک وسیله خوب برای وارد کردن ژن ها به داخل برنامه های به نژادی سنتی است‏‎ .‎
تشکیل سایبرید‎ ( Cybrid )‎
وقتی دو پروتوپلاست با هم امتزاج می یابند حالات مختلفی ممکن است حاصل شود اگر دو هسته با هم امتزاج یابند ‏یک دو رگ حقیقی تشکیل می شود . ولی اغلب دو هسته به طور مستقل از هم در سیتوپلاسم مخلوط به دست می ‏آیند و تشکیل هتروکاریون را می دهند . تلفات کروموزومی می تواند در یک یا هر دو هسته ایجاد شود . اگر تمام ‏هسته یکی از والدین از بین برود تنها یک هسته در مخلوط دو سیتوپلاسم باقی می ماند که این دو رگ را ‏سیتوپلاست یا سایبرید می گویند . سایبریدها را همچنین می توان با امتزاج یک پروتوپلاست طبیعی ( نرمال ) با ‏یک پروتوپلاست بدون هسته‏‎ ( enucleated ) ‎تولید کرد . پروتوپلاست بدون هسته رابا پرتو تابی یا حذف ‏فیزیکی هسته می توان به دست آورد . در تولید طبیعی دورگ از راه تکثیر جنسی دوگامت با هم امتزاج یافته و ‏تولید جنین زیگوت می نمایند . در این فرآیند سیتوپلاسم والد به طور طبیعی خارج شده و تنها صفات سیتوپلاسمی ‏والد مادری باقی می ماند . بنابراین تولید سایبرید یک روش مفید برای انتقال اطلاعات توارثی سیتوپلاسمی می ‏باشد . در حال حاضر محققین در مورد استفاده از سایبریدها برای انتقال قدرت مقاومت در برابر بعضی علف کش ‏ها مطالعه می کنند . این صفت مقاومت در روی ژنوم کلروپلاست حمل می شود . انتقال نر عقیمی سیتوپلاسمی ‏می تواند با انتقال ژن میتوکندری کنترل شود . مطالعه در روی سایبریدها همچنین برای تحقیق در امکان نوترکیبی ‏در ژنوم های برون کروموزومی از اهمیت زیادی برخوردار است‏‎ .‎
چشم اندازهای تکنولوژی پروتوپلاست‏
پیشرفت های قابل توجهی در دو دهه اخیر در تکنولوژی پروتوپلاست ( جدا کردن ، امتزاج ، کشت و باززایی ‏گیاه‎ )‎
در محصولات مهم زراعی از جمله غلات پدیدار شده است . امتزاج رویشی از طریق تولید هیبریدهای هسته ای نا ‏متقارن بین گونه های دور مجال فائق آمدن بر موانع تبادلات در تکثیر جنسی را فراهم کرده است . در مواردی که ‏پلی پلوئیدی و یا فقدان اندام های جنسی بارور ( محصولاتی که از طریق رویشی تکثیر می شوند ) مانعی بر سر ‏راه تبادلات ژنی است این تکنیک امکانات زیادی را در اختیار قرار می دهد . بعلاوه امتزاج پروتوپلاست ابزار ‏غیرقابل جایگزینی است که موجبات دست ورزی ژنوم اندامک ها را فراهم می کند و خلق ترکیبات جدیدی از ‏هسته و سیتوپلاسم را ممکن می سازد‏‎



۰ نظر
  • عنوان سایت منبع بانک مقالات فارسی